毛细管电泳

毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）是一种高效的分离分析技术，在生物化学、药物分析、环境监测等众多领域发挥着重要作用。 **一、原理** 1. 电泳原理   - 基于带电粒子在电场中的迁移差异进行分离。在电解质溶液中，带电粒子（如离子、蛋白质、核酸等）会受到电场力的作用而发生迁移。迁移速度与粒子的电荷量成正比，与粒子的半径和溶液的粘度成反比。   - 例如，对于阳离子，它会向阴极（负极）移动；对于阴离子，则向阳极（正极）移动。不同的带电粒子由于电荷、大小、形状等因素的不同，在相同电场下迁移速度不同，从而实现分离。 2. 毛细管作用   - 分离过程在毛细管中进行。毛细管通常是由石英等材料制成，其内径一般在25 - 100μm之间。毛细管内充满了缓冲液，作为电解质溶液。   - 毛细管具有很高的表面积 - 体积比，这使得在电场作用下产生的焦耳热能够快速散发，从而减少温度梯度对分离的影响，保证了分离的高效性和重现性。 3. 电渗流   - 电渗流是CE中一个重要的现象。在石英毛细管内壁，由于硅羟基（-SiOH）的存在，在一定pH条件下会发生解离，使管壁表面带负电荷。这些负电荷会吸引溶液中的阳离子，形成一个双电层。   - 当施加电场时，双电层中的阳离子会向阴极移动，带动整个缓冲液在毛细管中向阴极流动，这就是电渗流。电渗流的速度通常比离子的电泳速度快，并且对于大多数的CE分离模式，它是一个重要的推动分离的因素。 **二、分离模式** 1. 毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）   - 这是最基本的CE分离模式。在CZE中，样品中的不同带电粒子在电场作用下，以不同的电泳速度在缓冲液中迁移，由于电渗流的存在，所有粒子都向阴极移动，但移动速度不同，从而实现分离。   - 例如，在分离不同的有机酸时，根据它们的电荷和大小差异，在CZE模式下能够得到很好的分离。 2. 胶束电动毛细管色谱（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography，MECC）   - MECC结合了电泳和色谱的原理。在缓冲液中加入表面活性剂，当表面活性剂的浓度超过其临界胶束浓度时，会形成胶束。胶束具有疏水内核和亲水外壳。   - 中性分子可以在水相和胶束相之间分配，带电粒子则在电场作用下发生电泳和在胶束相中的分配，从而实现对中性分子和带电粒子的分离。例如，在药物分析中，可以用MECC分离药物中的中性成分和带电杂质。 3. 毛细管等电聚焦（Capillary Isoelectric Focusing，CIEF）   - CIEF是基于蛋白质等两性电解质的等电点（pI）进行分离的模式。在毛细管中充满含有两性电解质的溶液，施加电场后，两性电解质会在毛细管中形成pH梯度。   - 当蛋白质样品进入毛细管后，蛋白质会在pH梯度中迁移，直到到达其等电点的位置，此时蛋白质的净电荷为零，不再迁移。通过检测不同位置的蛋白质，可以实现根据等电点对蛋白质的分离。 4. 毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis，CGE）   - CGE类似于传统的凝胶电泳，在毛细管中填充凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）作为分离介质。凝胶具有筛分作用，能够根据分子大小对样品（如DNA、蛋白质等）进行分离。   - 例如，在DNA测序中，CGE可以快速、准确地分离不同长度的DNA片段，是现代基因分析的重要工具之一。 **三、技术流程** 1. 毛细管的准备   - 首先要选择合适的毛细管，根据分离对象和分离模式的要求，选择合适的内径、长度和材料。在使用前，需要对毛细管进行清洗，以去除杂质和残留的物质。   - 一般用氢氧化钠溶液、盐酸溶液等进行冲洗，然后用缓冲液平衡毛细管，使其达到合适的pH和离子强度。 2. 样品制备   - 根据样品的性质和检测目的，对样品进行适当的处理。例如，对于生物样品，可能需要进行提取、纯化、稀释等操作。   - 样品通常需要溶解在合适的缓冲液中，并且要保证样品中的成分不会与缓冲液或毛细管发生化学反应，影响分离效果。 3. 进样   - 有多种进样方式，如压力进样、电动进样等。压力进样是通过施加一定的压力，将样品引入毛细管；电动进样则是利用电场力将样品吸入毛细管。   - 进样量通常很小，一般在纳升（nL）级别，这是因为毛细管的内径很小，过多的样品会导致分离效果变差。 4. 分离   - 施加电场进行分离。电场强度根据样品和分离模式的不同而调整，一般在几百伏到几千伏之间。在分离过程中，通过检测系统实时监测分离情况。   - 分离时间因样品和分离模式而异，一般在几分钟到几十分钟之间。 5. 检测   - 可以采用多种检测方法，如紫外 - 可见吸收检测、荧光检测、电化学检测等。紫外 - 可见吸收检测是最常用的方法之一，利用样品中成分的紫外 - 可见吸收特性进行检测。   - 检测位置通常在毛细管的末端，通过检测窗口来观察和记录信号。根据检测信号的变化，可以得到分离后的样品的图谱，从而进行定性和定量分析。 **四、应用领域** 1. 生物分析   - 在蛋白质和核酸分析中应用广泛。例如，在蛋白质组学研究中，可以用于蛋白质的分离和鉴定；在基因分析中，用于DNA测序、基因分型和RNA分析等。   - 也可以用于生物样品中的小分子代谢物（如氨基酸、有机酸等）的检测，对于研究生物体内的代谢过程和疾病标志物的发现具有重要意义。 2. 药物分析   - 用于药物的质量控制，如检测药物中的杂质、异构体和降解产物。可以对药物的原料药和制剂进行快速、准确的分析。   - 在药物代谢研究中，能够分离和检测药物在体内代谢产生的各种代谢物，了解药物的代谢途径和代谢动力学。 3. 环境监测   - 可以检测环境样品（如水、土壤、大气等）中的污染物，如重金属离子、有机污染物（如农药、多环芳烃等）和生物毒素等。   - 对于评估环境质量、监测环境污染和研究污染物的迁移转化等方面具有重要价值。 **五、优势与局限性** 1. 优势   - 高效分离：能够在短时间内实现对复杂样品的高效分离，分离效率高，分辨率好。例如，在DNA测序中，毛细管电泳能够快速区分长度仅相差一个碱基的DNA片段。   - 样品用量少：进样量一般在纳升级别，这对于珍贵的生物样品（如临床样本）或少量的药物样品非常有利。   - 多种分离模式：可以根据不同的样品和分析目的选择合适的分离模式，灵活性高，能够满足多种分析需求。   - 自动化程度高：现代毛细管电泳仪器通常配备了先进的自动化进样、分离和检测系统，操作方便，结果重现性好。 2. 局限性   - 检测灵敏度有限：对于一些低浓度的样品，可能需要进行预富集等操作才能得到满意的检测结果。   - 复杂样品可能存在干扰：在分析复杂的生物或环境样品时，样品中的杂质可能会干扰分离和检测，需要进行充分的样品预处理。   - 仪器设备相对复杂：需要专业的毛细管电泳仪器，并且仪器的维护和操作需要一定的技术和经验，成本相对较高。