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流式细胞仪

流式细胞仪(Flow Cytometer)是一种对细胞或微粒进行快速定量分析和分选的高技术仪器,它在细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学等众多领域发挥着关键作用。**一、基本原理**1. 流体聚焦原理 - 细胞悬液被鞘液包裹,形成一个很细的液流。鞘液的作用是使细胞在流动过程中保持单个排列的状态,以确保每个细胞

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流式细胞仪

流式细胞仪(Flow Cytometer)是一种对细胞或微粒进行快速定量分析和分选的高技术仪器,它在细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学等众多领域发挥着关键作用。 **一、基本原理** 1. 流体聚焦原理   - 细胞悬液被鞘液包裹,形成一个很细的液流。鞘液的作用是使细胞在流动过程中保持单个排列的状态,以确保每个细胞能够依次通过检测区域。就像在一条狭窄的通道中,细胞被有序地“排队”前进,这种流体聚焦技术保证了检测的准确性和高效性。 2. 激光激发原理   - 当单个细胞依次通过检测区域时,会被一束或多束激光照射。激光的波长是根据需要检测的细胞特性和所使用的荧光染料来选择的。不同的细胞成分或标记的荧光分子在激光激发下会产生不同的光信号。例如,细胞内的DNA可以用特定的荧光染料染色,当被激光照射时,会发出与染料特性相关的荧光。 3. 光信号检测原理   - 细胞被激光激发后会产生多种光信号,主要包括前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)和荧光信号。FSC的强度与细胞的大小有关,细胞越大,FSC信号越强;SSC的强度主要反映细胞的内部复杂性,如细胞内颗粒的多少和大小。荧光信号则是由细胞内被荧光染料标记的成分发出的,这些成分可以是细胞表面抗原、细胞内蛋白、核酸等。通过不同的光学系统和探测器收集这些光信号,然后将光信号转换为电信号进行分析。 **二、仪器结构与组成** 1. 液流系统   - 包括样本注射器、鞘液容器和流动室。样本注射器精确地将细胞悬液注入流动室,鞘液容器提供鞘液,两者在流动室中形成稳定的液流,使细胞能够逐个通过检测区域。这个系统需要确保液流的稳定性和流速的准确性,以保证检测的重复性和准确性。 2. 光学系统   - 由激光光源、透镜、滤光片和反射镜等组成。激光光源产生高能量的激光束用于激发细胞。透镜用于聚焦和准直激光束,使激光能够准确地照射到细胞上。滤光片是非常关键的组件,它能够选择性地透过特定波长的光,将不同颜色的荧光信号分离出来,以便被不同的探测器检测。反射镜则用于改变光路方向,使光信号能够正确地传输到探测器。 3. 检测与信号处理系统   - 探测器主要有光电二极管和光电倍增管。光电二极管用于检测前向散射光和侧向散射光信号,光电倍增管则对微弱的荧光信号具有很高的灵敏度,用于检测荧光信号。信号处理系统将探测器收集到的电信号进行放大、数字化和分析。它可以对信号进行积分、计数等操作,将光信号转换为与细胞特性相关的数据,如细胞大小、荧光强度等。 4. 分选系统(部分流式细胞仪具备)   - 分选系统能够根据设定的细胞特性参数,将特定的细胞从混合的细胞群体中分离出来。它通过在检测区域后设置高速振动的压电晶体或其他装置,使含有目标细胞的液滴带上电荷,然后在电场的作用下,将目标细胞引导到特定的收集容器中,实现细胞的分选。 **三、实验流程与应用** 1. 样本制备   - 细胞悬液制备:对于实体组织,需要先将组织进行解离,使其成为单个细胞悬液。可以使用机械方法(如研磨)、酶解方法(如使用胰蛋白酶、胶原酶等)或两者结合的方式。对于血液样本,通常可以直接进行处理,如通过红细胞裂解液去除红细胞,得到白细胞悬液。   - 细胞标记:如果需要检测细胞内的特定蛋白、核酸或细胞表面抗原等,需要使用相应的荧光染料或荧光标记的抗体进行标记。标记过程需要在适当的条件下进行,如合适的温度、pH和时间,以确保标记的准确性和特异性。例如,使用荧光标记的抗CD4抗体可以标记T淋巴细胞表面的CD4抗原,用于检测CD4⁺T细胞的数量和比例。 2. 仪器设置与检测   - 仪器参数设置:根据检测的目标和样本的特点,设置合适的激光波长、检测通道的增益、阈值等参数。例如,在检测某种荧光标记的细胞时,需要根据荧光染料的发射波长设置相应的检测通道,并且调整增益使荧光信号能够在合适的范围内被检测到。   - 样本检测:将制备好的细胞悬液放入流式细胞仪的样本架上,启动检测程序。细胞在液流系统的作用下逐个通过检测区域,被激光激发后产生光信号,这些信号被探测器收集并经过信号处理系统分析,最终得到关于细胞数量、细胞大小、细胞表面和细胞内标记物的荧光强度等数据。 3. 数据分析   - 数据显示:流式细胞仪检测的数据可以以多种方式显示,如直方图、散点图和等高线图等。直方图主要用于显示一个参数的分布情况,例如细胞大小的分布;散点图可以同时显示两个参数之间的关系,如细胞的大小(FSC)和细胞内部复杂性(SSC)之间的关系,通过散点图可以区分不同类型的细胞群体;等高线图则类似于地图上的等高线,用于显示数据的密度分布情况。   - 数据分析方法:常用的数据分析包括设门(Gating)技术。设门是指在数据图上划定一个区域,将符合特定条件的细胞群体圈定出来,以便进一步分析这个群体的特征。例如,可以通过在FSC - SSC散点图上设门,将淋巴细胞群体圈定出来,然后分析这个群体中特定细胞表面抗原标记的细胞比例。还可以进行统计分析,如计算细胞群体的百分比、平均荧光强度等参数,用于比较不同样本之间的差异或评估实验处理的效果。 4. 应用领域   - 细胞生物学研究:可以用于细胞周期分析,通过对细胞内DNA含量的检测,确定细胞处于G₀/G₁期、S期还是G₂/M期。也可以用于研究细胞凋亡,通过检测细胞凋亡相关的标记物(如Annexin V)的表达情况,判断细胞是否处于凋亡状态。   - 免疫学研究:用于检测免疫细胞的表型和功能。例如,检测T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等免疫细胞的亚群比例,以及它们表面免疫分子的表达情况。这对于研究免疫反应、免疫疾病的发病机制和免疫治疗效果评估等方面具有重要意义。   - 血液学研究:在血液系统疾病的诊断和分型中发挥重要作用。例如,通过检测白血病细胞的免疫表型,可以辅助白血病的诊断和分类,确定白血病细胞的来源和分化程度。   - 肿瘤学研究:用于肿瘤细胞的检测和分析。可以研究肿瘤细胞的异质性,即同一肿瘤内部不同细胞之间的差异。也可以通过检测肿瘤细胞表面的标记物,用于肿瘤的早期诊断、肿瘤细胞的分选用于后续的研究或治疗,以及评估肿瘤治疗的效果。

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