北京科检检测技术集团有限公司欢迎您!
400-6863-880
科研服务
快速申请办理
称呼: *
电话: *

订单提交后,10分钟内,我们将安排工作人员和您联系!

联系方式

北京科检检测技术集团有限公司

电话:400-6863-880

邮箱:Beijingkejian@163.com

地址:北京市海淀区中关村南大街2号B座5层603

免疫组化

免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)是一种利用抗原 - 抗体特异性反应来定位和定性组织细胞中特定抗原的技术,在病理学、肿瘤学等众多领域发挥着关键作用。**一、原理**1. 抗原 - 抗体反应 - 基于抗原与抗体之间的高度特异性结合。组织细胞中的蛋白质、多肽等抗原成分能够被相应的特异性抗体识别并结合

400-6863-880 立即咨询

快速申请办理

称 呼 :
手机号码 :
备 注:

免疫组化

免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)是一种利用抗原 - 抗体特异性反应来定位和定性组织细胞中特定抗原的技术,在病理学、肿瘤学等众多领域发挥着关键作用。 **一、原理** 1. 抗原 - 抗体反应   - 基于抗原与抗体之间的高度特异性结合。组织细胞中的蛋白质、多肽等抗原成分能够被相应的特异性抗体识别并结合。这种结合就像一把钥匙(抗体)开一把锁(抗原),只针对特定的抗原结构。 2. 标记与显色   - 为了能够观察到抗原 - 抗体的结合,需要对抗体进行标记。常用的标记物有酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、荧光素、放射性核素等。以酶标记为例,当标记有酶的抗体与抗原结合后,加入相应的底物,酶会催化底物发生化学反应,产生有色产物,从而使含有抗原的组织部位显色,通过显微镜观察颜色的分布和强度来确定抗原的位置和表达水平。 **二、实验材料和设备** 1. 材料   - 组织样本:通常是石蜡切片或冰冻切片。石蜡切片制作过程包括固定、脱水、透明、浸蜡等步骤,组织结构保存较好,但抗原可能在处理过程中部分丢失;冰冻切片能较好地保留抗原活性,但组织结构相对不够清晰。   - 抗体:包括一抗(针对目标抗原)和二抗(能与一抗特异性结合,通常带有标记物)。一抗的选择根据目标抗原的性质和研究目的确定,二抗的选择要与一抗的物种来源相匹配。   - 固定剂:最常用的是4%多聚甲醛,用于固定组织细胞的形态和结构,防止抗原移位和降解。   - 缓冲液:如磷酸盐缓冲液(PBS),用于洗涤组织切片,去除未结合的抗体和其他杂质。   - 封闭液:一般为1% - 5%牛血清白蛋白(BSA)或血清(如山羊血清),用于封闭组织切片中的非特异性结合位点,减少背景染色。   - 显色剂:如果是酶标记的抗体,根据标记酶的不同选择相应的显色剂。如辣根过氧化物酶常用3,3' - 二氨基联苯胺(DAB)作为显色剂,碱性磷酸酶常用萘酚 - AS - MX磷酸盐和坚固蓝RR盐作为显色剂。显色后产生的颜色(如DAB显色为棕褐色)可以指示抗原的位置。 2. 设备   - 切片机:用于制作石蜡切片或冰冻切片。   - 显微镜:用于观察染色后的组织切片,评估抗原的定位和表达水平。普通光学显微镜用于观察显色后的切片;荧光显微镜用于荧光标记的免疫组化。   - 温箱:用于抗体孵育等步骤,保持合适的温度,通常为37℃。   - 染色缸:用于盛放各种试剂,方便组织切片的浸泡处理。 **三、实验步骤** 1. 石蜡切片免疫组化步骤   - 脱蜡至水:     - 将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ中浸泡10 - 15分钟,使石蜡溶解,更换二甲苯Ⅱ,再浸泡10 - 15分钟。     - 然后依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各浸泡5分钟左右,最后用蒸馏水冲洗切片,使切片从有机相过渡到水相。   - 抗原修复:     - 由于在石蜡切片制作过程中,抗原可能会被掩盖或破坏,通常需要进行抗原修复。常用的方法有热修复和酶修复。热修复是将切片放入柠檬酸缓冲液(pH 6.0)或EDTA缓冲液(pH 8.0 - 9.0)中,在微波炉或高压锅中加热至沸腾,保持一定时间(如微波炉中高火5 - 10分钟,高压锅喷气后2 - 3分钟),然后自然冷却。酶修复则是使用蛋白酶K或胰蛋白酶等酶溶液在合适的温度(如37℃)和时间(如10 - 30分钟)下处理切片。   - 封闭:     - 将切片放入封闭液(如1% - 5% BSA或山羊血清)中,在室温下孵育30 - 60分钟,以封闭非特异性结合位点。   - 一抗孵育:     - 用封闭液将一抗稀释至合适浓度,滴加在切片上,确保切片完全被抗体溶液覆盖。将切片放入湿盒中,在4℃下孵育过夜或在37℃下孵育1 - 2小时。孵育后用PBS洗涤3 - 5次,每次5分钟。   - 二抗孵育:     - 将标记有酶的二抗用封闭液稀释,滴加在切片上,放入湿盒中,在37℃下孵育30 - 60分钟。孵育后用PBS洗涤3 - 5次,每次5分钟。   - 显色:     - 根据二抗标记酶的类型,选择合适的显色剂。以DAB显色为例,将DAB溶液按照说明书配制,滴加在切片上,在显微镜下观察显色情况,显色时间一般为几分钟,当出现明显的棕褐色显色且背景较干净时,用蒸馏水终止显色反应。   - 复染:     - 为了更好地观察组织结构,常用苏木精对细胞核进行复染,使细胞核染成蓝紫色。染色后用蒸馏水冲洗,然后依次经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明,最后用中性树胶封片。 2. 冰冻切片免疫组化步骤   - 固定:     - 从冰箱中取出冰冻切片,立即放入4%多聚甲醛固定10 - 15分钟,然后用PBS洗涤。   - 洗涤和封闭:     - 用PBS洗涤切片3 - 5次,每次5分钟。然后进行封闭,步骤同石蜡切片。   - 一抗和二抗孵育:     - 操作方法与石蜡切片类似,但由于冰冻切片抗原活性保留较好,一抗和二抗的孵育时间和浓度可能需要根据实际情况调整。   - 显色、复染和封片:     - 与石蜡切片步骤相同,但要注意冰冻切片较薄,在处理过程中要更加小心,避免切片损坏。 **四、结果分析** 1. 阳性信号的定位   - 通过观察显色部位,确定抗原在组织细胞中的位置,如细胞表面、细胞质或细胞核。这有助于判断抗原的功能和细胞内的分布规律。例如,某些转录因子主要定位于细胞核,其阳性信号也应在细胞核内出现。 2. 阳性信号的强度   - 阳性信号的强弱可以在一定程度上反映抗原的表达水平。可以采用半定量的方法进行评估,如根据染色强度(无染色、弱阳性、中度阳性、强阳性)和阳性细胞所占比例进行评分。这种评估对于比较不同组织样本之间抗原表达的差异、研究疾病状态下抗原表达的变化等具有重要意义。 3. 与组织结构和其他标记的结合分析   - 将免疫组化结果与组织的正常结构和其他细胞标记相结合进行分析。例如,在肿瘤组织中,观察肿瘤细胞标记抗原的同时,结合组织学形态和其他细胞成分(如血管内皮细胞、淋巴细胞等)的标记,可以更好地理解肿瘤的生物学特性,如肿瘤细胞的侵袭性、免疫细胞的浸润情况等。 **五、注意事项** 1. 抗原修复   - 抗原修复是影响免疫组化结果的关键步骤。不同的抗原可能需要不同的修复方法和条件,要根据抗体说明书和预实验确定最佳的抗原修复方式。修复过度可能导致抗原破坏或组织结构受损,修复不足则可能无法充分暴露抗原,影响抗体结合。 2. 抗体质量和浓度   - 选择高质量的抗体是实验成功的关键。要根据研究目的仔细选择一抗和二抗,注意抗体的特异性、灵敏度和适用范围。同时,抗体浓度过高可能导致非特异性染色增加,浓度过低则可能无法检测到抗原,需要通过预实验来优化抗体浓度。 3. 背景染色控制   - 背景染色是免疫组化中常见的问题,主要原因包括非特异性抗体结合、内源性酶活性和显色剂的非特异性反应等。要充分利用封闭液进行封闭,严格控制抗体孵育条件,选择合适的显色剂和抑制内源性酶的方法,以减少背景染色,提高结果的准确性。


上一篇:免疫荧光
下一篇:特殊染色

相关阅读

特殊染色

特殊染色是病理学和组织学中使用的一种染色方法,用于显示组织或细胞中的特定成分,这些成分在常规的苏木精 - 伊红(HE)染色中可能无法清晰地显示。以下是关于特殊染···...

免疫组化

免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)是一种利用抗原 - 抗体特异性反应来定位和定性组织细胞中特定抗原的技术,在病理学、肿瘤学等众多领域发···...

免疫荧光

免疫荧光是一种将免疫学方法(抗原 - 抗体反应)与荧光标记技术相结合的实验技术,用于定位和可视化细胞或组织中的特定抗原,以下是详细介绍: **一、原理**···...

Masson染色

Masson染色是一种用于显示组织中纤维成分的特殊染色方法,主要用于区分胶原纤维和肌纤维,在病理学和组织学研究中有广泛的应用。 **一、染色原理** ···...

客户服务
免费回电
咨询电话
时间:8:00-18:00
电话:400-6863-880

售后电话
时间:8:00-18:00
电话:400-8696-220
免费咨询
预约售后
顶部